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分子生物学检测

分子生物学作为现代生物技术中*为*的实验手段之一,已经广泛渗透到生命科学的各个领域,在基础研究、医l疗诊断等领域均起到了非常重要的作用。

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分子与质粒载体构建


实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步:,T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物;然后,酶—AMP复合物再结合到具有5’*基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;后产生一个新的*二酯键,pcr检测,把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法,为了防止载体本身的自连,可以通过(牛碱性*酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。





ELISA 是一种结合*原、*ti特异性反应和酶对底物高xiao催化作用的高敏*免yi学实验技术。ELISA 的基础是*原或*ti的固相化及*原或*ti的酶标记。结合在固相载体表面的*原或*ti仍保持其免yi学活性,泰州pcr,酶标记的*原或*ti既保留其免yi学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的*ti或*原)与固相载体表面的*原或*ti起反应,洗涤使固相载体上形成的*原*ti复合物与液体中的其他物质分开,再加入酶标记的*原或*ti,通过反应使其结合在固相载体上。此时固相上的酶含量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。




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